Human COVID-19 Spike Protein IgM ELISA 检测试剂盒

Catalog Number: ATK00032

样品清单及储存条件

试剂盒功能

用于测定血清和血浆中针对 S 蛋白的 IgM 抗体的浓度。

试剂盒分析原理

本试剂盒采用间接 ELISA 分析技术，将 S 蛋白预先包被在酶标板上，之后将阳性对照样本和分析样本分别加入到微孔中，样本中针对 S 蛋白的 IgM 抗体会和预包被的 S 蛋白结合，清洗掉未结合的物质， 再加入生物素标记的抗人 IgM 二抗，清洗掉未结合的抗体，再加入 HRP 标记的链酶亲和素，清洗掉未结合的酶，将显色底物溶液添加到微孔中显色，显色强度与样品中针对 S 蛋白的 IgM 抗体浓度成正比。

所需设备及试剂

• 450 nm 滤光片酶标仪，含 540 nm 或 570nm 校正波长更佳

• 单道或多道微量移液器，移液器枪头

• 去离子水

• 500 mL 量筒

• 样品稀释管或不同规格EP 管

• 吸水纸

样品收集和储存

1） 血清：全血室温放置 60 分钟或 4℃过夜，然后 1000 x g 离心 15 分钟，取上清检测，或分装后于

≤-20℃冰箱保存，避免样品反复冻融。

2） 血浆：使用 EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝剂收集血浆，样品采集后 30 分钟内 1000 x g 离心 15

分钟，取上清检测，或分装后于≤-20℃冰箱保存，避免样品反复冻融。

试剂准备

使用前将所有试剂和标本置于室温平衡。

1. 浓缩清洗液: 如果浓缩液中有晶体析出，加热至室温并轻轻混合，直到晶体完全溶解，25mL 浓缩清洗液使用离子水定容至 500mL，得到清洗工作液。

2. 阳性对照标准品：阳性对照浓度为 0.16mg/mL, 使用样本稀释液 1:20 稀释阳性对照得到第一个标

准点 8000ng/mL，依次进行倍比稀释操作得到共计 7 个标准点 8000ng/mL、4000ng/mL、2000 ng/mL、 1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL 最后再以 100ul 样本稀释液为零标准（0 ng/mL）， 共计 8 个标准点，建议每个标准点至少做 2 个平行孔。

3. 血清，血浆样本：推荐血清，血浆使用样本稀释液 1:10~1:1000 稀释后上样。如果样本检测值超出标准曲线范围，可适当调整稀释倍数并重新测定，或预估样本中抗体浓度，在实验之前预先稀释

数个梯度同时进行测定。

4. 检测溶液 A：震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心，使液体集中于管底，临用前取合适体积用检测溶液稀释液 1:1000 稀释至工作浓度。

5. 检测溶液 B：震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心，使液体集中于管底，临用前取合适体积用检测溶液稀释液 1:2000 稀释至工作浓度。

6. 显色液: 避光保存，显色时 100μL /孔。

7. 终止液：显色完毕后 50μL /孔。

使用前将所有试剂和样品置于室温。建议对所有标准品、对照品和样品进行一式两份的分析。

1. 按照前面章节的指示准备所有试剂和准备工作。

2. 从板架上取下多余的微孔板条，将其放回装有干燥剂包的箔袋中，然后重新密封保存于-20℃。

3. 每孔加入 100μL 稀释好的阳性对照标准品（共计 8 点）和稀释好的待测样本，用封板膜封住，37℃ 孵育 60 分钟。

4. 弃去孔内液体，每孔加入 300μL 的清洗工作液，轻微震荡后弃去孔内液体，将酶标板倒扣在吸水纸上轻拍，使残留在孔内的液体全部去除，重复洗板 3 次，此过程也可采用尖嘴喷射瓶，多道移

液器或自动洗板机来完成。

5. 每孔加入 100μL 检测溶液 A 工作液（生物素标记），用新的封板膜封住，37℃孵育 60 分钟。

6. 重复步骤 4 中的洗板程序。

7. 每孔加入 100μL 检测溶液 B 工作液（HRP 标记），用新的封板膜封住。37℃孵育 30 分钟。

8. 重复步骤 4 中的洗板程序。

9. 每孔加入 100μL 显色液，37℃避光显色 10 分钟。

10. 每孔加入 50μL 终止液，孔里的颜色应该由蓝色变至黄色，如果孔内颜色为绿色或颜色变化不均匀， 轻轻震动酶标板板使颜色均一。

11. 擦干酶标板底部水气，立刻用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度值（O.D.值），如果波长校正可用，则设置为 540 nm 或 570 nm，如果波长校正不可用，则从 450 nm 的读数中减去 540 nm 或 570 nm 的读数，这种修正可去除酶标板读数中的光学偏差，如果没有校正波长，可直接读取450 nm 的读数，但读值有可能会更高、更不准确。

标准曲线制作

取每个阳性对照和样本的复孔平均值 O.D.，减去零标准孔平均值 O.D.后，以阳性对照的浓度为横坐标， O.D.值为纵坐标，绘出标准曲线（R² 值越趋近于 1 曲线越精确），然后再将样品的平均值 O.D.带入标准曲线的回归方程式，计算出样品中目标蛋白浓度。

如果样品已经稀释，从标准曲线上算出的浓度须乘以稀释系数，即为样品的实际浓度。

检测范围

125ng/mL—8000ng/mL

最低检测限(MDD)

100ng/mL

MDD 是测试 20 个零标准（稀释液）的平均 O.D.值上加两倍标准差后计算相应的浓度来确定的。

精密度

批内差： CV<12%

批间差： CV<15%

 稳定性

试剂盒按推荐温度保存 6 个月，信号强度降低小于 10%。

 实验细节说明

1. 在试剂盒标签上的有效期内使用，不要与其他厂家的试剂盒混合使用。

2. 如果样本检测值超出标准曲线范围，可适当调整稀释倍数并重新测定，或预估样本中抗体浓度，在实验之前预先稀释数个梯度同时进行测定。

3. 为避免交叉污染，不同标准品、样本、试剂的加样需更换移液枪头，每管试剂使用单独的容器储存。

4. 在孵育过程中贴紧封板膜。

5. 显色液避光保存，临用前 15 分钟从冰箱取出在室温平衡。

6. 浓缩清洗液（20×）需使用去离子水 1：20 稀释至工作浓度，去离子水不包含在试剂盒中，需实验人员自备。

7. 终止液为酸性溶液，具有轻微腐蚀性，使用时避免接触皮肤、眼、耳、口等暴露部位，如不慎接触， 使用大量清水冲洗后观察接触部位反应，如情节严重请及时就医。

8. 试剂盒酶标板条可按需拆卸使用，已开封的试剂盒建议在 1 个月内使用，未开封的试剂盒所有试剂均按试剂瓶标签上所示保存，收到试剂盒后请将阳性对照、检测溶液 A、检测溶液 B、以及预包板保存于-20℃，其余试剂请置于 4 ℃保存备用。