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小鼠IPS的制备
背景资料
干细胞分为成体干细胞和胚胎干(ES)细胞, ES细胞是从囊胚内细胞团中分离得到的一种二倍体细胞,具有发育和分化成为机体内几乎所有
组织细胞类型的潜能. 但ES细胞的研究一直存在激烈的伦理学争论, 为避开伦理学争论, 国外学者通过体细胞体外基因转染技术建立诱导性
多潜能干(iPS)细胞系。
IPS的发展
2006. 日本Takahashi和Yamanaka 首次通过逆转录作用建立小鼠IPS（induced Pluripotent Stemcells ）。Oct4, Sox2,c-myc 和Klf4.
2007.12 . Yamanaka和美国威斯康辛大学的Thomson小组分别在Cell及Science发表文章证实了人IPS的建立。Thomson :
Oct4, Sox2, Nanog 和Lin28
近来，3个因子(Oct4、Sox2和Klf4)改良方案
来源细胞：MEF，骨髓细胞，淋巴细胞，内脏组织细胞等
Ips的定义
Ips(induced pluripotent stem cells)：通过体外基因转染技术诱导体细胞基因组重新编程形成的ES样细胞。
细胞核重编程是指,成熟的细胞由分化的状态被逆转到一种未分化状态的过程
iPS 细胞建立的大致过程
实验流程
试剂组成
1.MEF细胞完全培养基：高糖DMEM+10%FCS（GIBCO）+ NEAA+双抗
2.IPS培养基：高糖DMEM+15%FCS（GIBCO） +LIF+GlutaMAX + 2-ME+ NEAA+双抗
3.Plat-E培养基：高糖DMEM+10%FCS（GIBCO） +GlutaMAX +双抗
MEF的制备
1. 13.5天孕鼠
2 . 0.125%胰酶37度连续消化15min 每个5min取出混匀一次
3.接种密度；每只胚胎一T175
4.p0冻存，每瓶冻存3管。
5.使用时复苏100mm培养皿，1：4传代，传至P3待用
病毒的包装
1.包装细胞：Plat-E(小鼠逆转录病毒)
Plat-A (人逆转录病毒)293FT(慢病毒)
2. 质粒：Oct3/4, Sox2, c-Myc, and Klf4（Yamanaka’s laboratory）
OCT4, SOX2,NANOG, LIN28（Thomson’s laboratory）
病毒包装及MEF的感染
1. Day1: 接种Plat-E细胞;8X106 /100mm皿
2. Day2下午: Plat-E 80%-90%融合，加入质粒（24ug）及 lipo（39ul）。
3. Day3上午: 转染后换液：10%FCS/HD
Day3下午：接种MEF（P3）至六孔板，密度40000/孔。
4. Day4下午：分别收集病毒，过滤后加入至
准备好的MEF中，Plat-E培养盘重新加入培养液。
5. Day5下午：再次收集病毒，加入到MEF中。感染过夜后换为MEF培养液
小鼠IPS的形成
ISP的形成
IPS的鉴定
嵌合体
应用
Hanna 等人应用自体皮肤来源的IPS 治疗小鼠贫血模型，取得了不错的效果
利用IPS诱导分化形成的神经元注入胎脑改善大鼠帕金森症状
Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 和
Oct4/Sox2/Nanog/Lin28作用
Oct4 是多能性调控中一个至关重要的因子, 缺失了Oct4, 根本无法得到ES 细胞。
Oct4 对于很多基因的调控需要与Sox2 进行协同作用。
c-myc 是Lif/STAT3 和Wnt 信号通路的一个主要的下游基因。这两条信号通路对于多能性的维持都很重要.
Klf4 具有癌基因和肿瘤抑制基因的双重特性. 它的过表达可以维持Oct4 的表达, 并抑制ES 细胞的分化。
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